ABSTRACT
Background: Mexico is innovating in the livestock industry through in vitro generation of bovine embryos with technologies such as well-of-the-well (WOW) and polyester mesh (PM) single-embryo culture systems. These techniques allow to maintain embryos in separate areas of a shared culture medium. Objective: To compare the quantity and quality of bovine embryos produced in WOW and PM culture systems versus the conventional (CG) culture system. Methods: In total, 345 embryos fertilized in vitro were evaluated for blastocyst yield in the three culture systems. To count blastocyst cell numbers, 69 embryos in each system were differentially stained for trophectoderm (TE), inner cell mass (ICM), and apoptotic cells. A qPCR gene expression analysis was performed for embryos in all three systems. Results: The WOW, PM and CG systems developed similar amount of blastocysts (41, 35 and 36%, respectively; p>0.05). Blastocysts in all three systems showed adequate amounts of ICM and apoptotic cells. Blastocysts in the PM system showed a greater number of TE cells [63.7 versus 58.6% in the CG system (p0.05). The ATP5B expression was higher in WOW than in PM (p0.05). The TJP3 expression was higher in PM than in WOW and CG (p<0.05). Expression of ID2 and CLDN4 was higher in WOW than in PM and CG (p<0.05). The biplot graphic from Principal Component Analysis (PCA) revealed that CG was located near degenerated embryos, whereas PM was located near arrested embryos, larger ICM and TE, and TJP3 expression. The WOW was located toward blastocysts, morulae, and expression of CLDN4, ID2 and GNAS. Conclusion: Compared with CG, both the PM and WOW systems are good options for culturing single embryos in the bovine model. Moreover, the PCA results suggest that embryos developed in the WOW system have greater capacity for generating blastocysts with increased ability to form TE and ICM layers, which might improve implantation.
Antecedentes: México está innovando en la industria ganadera a través de la generación in vitro de embriones bovinos con tecnologías de cultivo individual como lo son Pozo dentro de Pozo (WOW) y Malla de Poliéster (PM). Estos mantienen los embriones en áreas separadas mientras comparten un mismo medio de cultivo celular. Objetivo: Comparar la cantidad y calidad de embriones bovinos producidos en los sistemas WOW y PM contra el sistema de cultivo convencional en grupo (CG). Métodos: En total se evaluaron 345 embriones fertilizados in vitro para determinar la producción de blastocistos generados en los tres sistemas. Para contar el número de células por blastocisto, 69 embriones en cada sistema se tiñeron diferencialmente para trofectodermo (TE), masa celular interna (ICM) y células apoptóticas. Se realizó un análisis de expresión génica por qPCR de los embriones obtenidos en los tres sistemas. Resultados: Los sistemas WOW, PM y CG desarrollaron similares cantidades de blastocistos (41, 35 y 36%, respectivamente; p>0,05). Los blastocistos en los tres sistemas mostraron cantidades adecuadas de ICM y células apoptóticas. Los blastocistos en el sistema PM mostraron un mayor número de células TE [63,7% versus 58,6% en el sistema CG (p0,05). La expresión de ATP5B fue mayor en WOW que en PM (p<0,05), pero similar a CG (p<0,05). La expresión de TJP3 fue mayor en PM que en WOW y CG (p<0,05). La expresión de ID2 y CLDN4 fue mayor en WOW que en PM y CG (p<0,05). El gráfico de biplot del análisis de componentes principales reveló que CG se encontró cerca de embriones degenerados, mientras que PM se encontró cerca de embriones en arresto, ICM, TE, y TJP3. El WOW se localizó hacia blastocistos, mórulas y la expresión de CLDN4, ID2 y GNAS. Conclusión: En el modelo bovino los sistemas PM y WOW son buenas opciones para cultivar embriones individuales, ya que se obtienen resultados muy similares a los obtenidos con el sistema CG. Además, los resultados de PCA sugieren que los embriones individuales desarrollados en el sistema WOW generan blastocistos con mayor capacidad de formar TE e ICM, lo que podría mejorar su éxito de implantación.
Antecedentes: O México está inovando na indústria pecuária por meio da geração in vitro de embriões bovinos com tecnologias de cultura de embriões individuais, bem como em poço (WOW) e malha de poliéster (PM). Estes mantêm os embriões em áreas separadas, enquanto compartilham o mesmo meio de cultura de células. Objetivo: Comparar a quantidade e a qualidade de embriões bovinos produzidos nos sistemas de cultura WOW e PM com o sistema convencional de cultura em grupo (CG). Métodos: No total, 345 embriões fertilizados in vitro foram avaliados para determinar a produção de blastocistos gerados nos três sistemas. O número de células por blatocisto foi contado, 69 embriões em cada sistema foram diferencialmente corados para trofectoderme (TE), massa celular interna (ICM) e células apoptóticas. Uma análise de expressão gênica qPCR foi realizada para os embriões obtidos nos três sistemas. Resultados: Os sistemas WOW, PM e CG desenvolveram quantidades semelhantes de blastocistos (41, 35 e 36%, respectivamente; p>0,05). Os blastocistos nos três sistemas mostraram quantidades adequadas de ICM e células apoptóticas. Os blastocistos no sistema PM mostraram um número maior de células TE [63,7 versus 58,6% no sistema CG (p0,05). A expressão de ATP5B foi maior no WOW do que no PM (p<0,05), mas semelhante ao GC (p<0,05). A expressão de TJP3 foi maior no PM do que no WOW e CG (p<0,05). A expressão de ID2 e CLDN4 foi maior no WOW do que no PM e CG (p<0,05). O gráfico biplot da análise de componentes principais revelou que CG foi encontrado próximo a embriões degenerados, enquanto PM foi encontrado próximo a embriões presos, ICM, TE e TJP3. WOW foi encontrado para ter blastocistos, mórulas e a expressão de CLDN4, ID2 e GNAS. Conclusão: Em comparação com o CG, os sistemas PM e WOW são boas opções para a cultura de embriões individuais no modelo bovino. Além disso, os resultados da PCA sugerem que embriões individuais desenvolvidos no sistema WOW têm maior capacidade de desenvolver blastocistos com maior capacidade de formar as camadas TE e ICM, o que poderia melhorar seu sucesso de implantação.
ABSTRACT
A new and effective protocol to culture bovine embryos without coculture and with individualized culture media has been established, which would allow the study of a single embryo's metabolism. For this purpose, bovine embryos were produced in vitro by standard protocols in three different types of media: KSOM, SOFaa, and KSOM followed by SOFaa at day 2. Presumptive zygotes were divided into six groups: control, cultured in groups (C-KSOM, C-SOFaa, and C-KS), and individual well system (W-KSOM, W-SOFaa, and W-KS). Cleavage and blastocyst rates were assessed on days 2 and 7 respectively. Relative quantification of transcripts related to important metabolic processes (GLUT1, GLUT3, GSK3, SOD1, HSPD1, G6PD) were assessed in C-KS and W-KS blastocysts. Results show that cleavage was significantly higher only in W-KSOM when compared to C-KSOM, while blastocyst rates differ only between C-SOF and W-SOF. All the other comparisons did not present statistical difference. Moreover, gene expression analysis revealed that blastocysts cultured in groups and in the individual well system present similar transcription patterns. Thus, the obtained conclusion was that the individual well system performed could be used as an effective alternative protocol for individual culture of bovine embryos, since the rates are similar to routine group culture.(AU)
Estabeleceu-se um protocolo novo e eficaz de cultivo individual de embriões bovinos sem o uso de cocultivo e sem compartilhamento de meio visando à análise do metabolismo individual do embrião. Para isso, embriões foram produzidos in vitro por protocolos convencionais em três diferentes tipos de meio: KSOM, SOFaa e KSOM seguido por SOFaa no dia 2. Os zigotos presumíveis foram divididos em seis grupos: controles (cultivo em grupo C-KSOM, C-SOFaa e C-KS) e sistema de poços individuais (W-KSOM, W-SOFaa e W-KS). As taxas de clivagem foram avaliadas nos dias 2 e 7, respectivamente. Além disso, a quantificação relativa de transcritos relacionados a importantes processos metabólicos (GLUT1, GLUT3, GSK3, SOD1, HSPD1 e G6PD) foi avaliada nos blastocistos dos grupos C-KS e W-KS. Os resultados mostram que as taxas de clivagem foram maiores apenas no grupo W-KSOM quando comparado ao grupo C-KSOM, enquanto a taxa de blastocistos diferiu apenas entre os grupos C e W-SOF. Além disso, a análise da expressão gênica mostrou que blastocistos cultivados em grupo ou em sistema de poços individuais são semelhantes quanto à expressão gênica. Assim, a conclusão obtida foi que o sistema individual proposto pode ser utilizado como um protocolo alternativo eficiente para o cultivo individual de embriões de bovino, uma vez que suas características permanecem semelhantes àquelas do sistema convencional de produção de embriões.(AU)